（一）真菌的污染

真菌的种类很多，污染培养细胞的多为酵母菌、烟曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌等。酵母菌是最常见的污染真菌，酵母菌形态呈卵形或圆形，菌体透亮，生长速度较慢，散在细胞周边和细胞之间生长，容易被忽略。霉菌污染后多数在培养液中形成白色或浅黄色漂浮物。一般肉眼可见，较易被发现，短期内培养液多不混浊，倒置显微镜下可见在细胞之间有纵横交错穿行的丝状、管状及树枝状菌丝，并悬浮漂荡在培养液中。很多菌丝在高倍镜下可见到有链状排列的菌珠。有时通过显微镜观察可能发现瓶底外面生长的菌丝，不要错当培养瓶内的污染。瓶外的污染物，需及时用酒精棉球擦洗清涂，以防其通过瓶口传入瓶内。

（二）细菌污染

细菌的污染较为多见的是大肠杆菌、白色葡萄球菌、假单孢菌等。加入抗生素的培养液一般可预防和排除个别少量细菌的污染。一旦发生细菌污染很易发现，多数情况下培养液短期内颜色变黄，表明有大量酸性物质产生，出现明显混浊现象；有时静置的培养瓶液体看不到有混浊，但稍加振荡，就有很多混浊物漂起。倒置显微镜下观察，可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮，有时在细胞表面和周围有大量细菌存在，细胞生长停止并有中毒表现。必要时可取少量培养液涂片染色检查以证实细菌种类；有的培养液改变不明显而又疑似有污染，亦可取出少量培养液向肉汤细菌培养基内滴加，37℃培养可以检测是否污染。

细菌和真菌污染多在传代、换液、加样等开放性操作之后发生，而且由于增生迅速，多在发生污染48h以内就已明显。因而要在实验的最初2d密切观察实验样本是否有污染发生，这样可以及时采取措施予以补救或排除。

（三）支原体污染

支原体的污染是一个常见而又棘手的问题。近几年随着实验设备的改善和技术方法的改进，支原体污染的防治有了一定进展。

支原体是一种大小介于细菌和病毒之间（最小直径0.2ɥm）、并独立生活的微生物。约有1%可通过滤菌器。支原体无细胞壁，形态呈高度多形性，可为圆形、丝状或梨形。支原体形态多变，在光镜下不易看清内部结构。电镜下观察支原体膜为三层结构，其中央有电子密度大的密集颗粒群或丝状的中心束。支原体多吸附或散在分布于细胞表面和细胞之间。横断面与细胞微绒毛相似，但微绒毛电子密度比支原体小，且中央无颗粒群或中央束。

支原体代谢需固醇类物质，部分种类需要精氨酸、O2或葡萄糖，每一种支原体都有自身特点。多数支原体适合于偏碱条件下生存（pH7.6~8.0）。对酸耐受性差，对热比较敏感，对一般抗生素不敏感。

为确定有无支原体污染可进行如下检测。

（1）相差显微镜检测：

①直接观察法：将细胞接种于事先放置于培养瓶内的盖玻片上，24h后取出，用相差油镜观察，支原体呈暗色微小颗粒位于细胞表面和细胞之间，有类似布朗运动的表现。注意：支原体与细胞破碎后溢出的细胞内容物如线粒体等颇为相似，应仔细加以区别。

②低渗溶胀处理地衣红染色观察法。

概述

本法为固定染色法，通过对细胞低渗处理，使细胞体积扩张，细胞膜表面的皱折和结构减少，使附在细胞表面的支原体容易被识别。该方法简便易行，标本可长期保存，不仅适于检测支原体，亦可用于检测真菌和细菌。

步骤

①取材：用盖玻片培养法或培养液均可；用培养液时，先吸取培养液1ml，500~800r/min，离心5min后，去上清，余0.2ml备用。

②低渗溶胀处理：用新鲜配制的0.5%的枸橼酸溶液，处理盖玻片上的细胞或加入到上述步骤中制备的0.2ml中（悬液）放置10min。

③固定：用新配制的Carmoy液固定两次，共10min，取出盖玻片晾干，如为培养液，则应先离心弃上清固定液，余沉淀物0.2ml，制成涂片2～3张。

④染色：用2%醋酸地衣红染5min，染液配法如下：

地衣红 2g

冰醋酸 60mL

加蒸馏水至 100mL

支原体和细胞被染成紫红色，如染色过深可用75%乙醇脱色

⑤封片：纯乙醇过3次，每次1min，封入Euparal或树胶中。镜下观察支原体呈暗紫色小体，附于细胞外或散在于细胞之间。

（2）荧光染色法：荧光染色用能与DNA特性结合的荧光染料Hoechst33258，可使支原体内DNA着色，染色后用荧光显微镜观察。具体方法如下：首先将细胞接种盖玻片上，在细胞未长满前取出玻片，用不含酚红的Hanks漂洗一下，用1:3醋酸甲醇固定10min，然后，用生理盐水漂洗，置于用生理盐水配制浓度为50ɥg/mL的Hoechst33258中染色10min，染色后用蒸馏水洗1～2min，向细胞面滴加pH5.5的磷酸缓冲液数滴，然后，置荧光显微镜下观察。镜下支原体为散在于细胞周围或附于细胞膜表面的亮绿色小点。

（3）电镜检查：用扫描电镜方法简便快速，也可以利用透射电镜，具体方法与培养细胞电镜标本制备和观察方法相同可参考相关章节。

      （4）DNA分子杂交检查：按试剂盒说明书进行，检出率高，但方法较复杂。