细胞培养工作中要注意的另一个问题是防止不同细胞间交叉污染。细胞污染和细菌污染不同，细胞污染是由于在培养操作过程中各种细胞同时进行，而所用器具或液体混杂使用所致。这种污染使培养细胞不同种类之间发生混乱，细胞生长特性、形态发生变化，有些变化较轻微、不易察觉，有些则可能由于污染的细胞具有生长优势导致原有细胞的增殖抑制、最终死亡。污染过的细胞由于种类不纯、无法用来进行实验研究。

要有效防止细胞交叉污染的发生应做到以下几点。

（1）在进行多个种类细胞培养操作时，所用器具要严格区分，最好做上标记便于辨别，避免一起使用时发生混乱。对每一种细胞按顺序进行操作。

（2）在进行细胞换液或传代操作时：注射器和滴管不要触及培养液瓶瓶口，以免把细胞带到培养液瓶中，以防止进行其他细胞培养操作时导致细胞污染。

（3）所有从别处转来的细胞或自己所建的细胞系都要在早期留有充足的冻存储备，一旦怀疑发生细胞交叉污染，可做细胞遗传学方面的鉴定，如发现原有标志性遗传物质发生改变，可以复苏早期冻存细胞使用。