（一）三维培养技术的概述

三维细胞培养技术（three-dimen-sionalcell culture，TDCC）是指将具有三维结构不同材料的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养，使细胞能够在载体的三维立体空间结构中迁移、生长，构成三维的细胞－载体复合物。所创建的细胞生长环境，最大限度地模拟了体内环境。

虽然二维培养模式已经在世界各地的成千上万个实验室里作为细胞培养的常规方法应用了数十年之久。但近年来，随着组织工程和再生医学的发展以及传统的二维培养并不能很好地满足大规模的细胞应用需要和进行组织器官的发育生理学方面的研究，细胞培养技术也已经逐步地从二维培养发展到三维培养。

三维细胞培养技术模拟正常细胞生长环境、复制复杂的组织结构和体内形态分化等细胞活动和细胞间反应、预测病程、高通量药物筛选实验、肿瘤球体检测、器官再生研究、胚胎干细胞（ES）和诱导式多能性干细胞（iPS）的扩张和分化等。三维细胞培养法可改变细胞的形态及蛋白产物。Benya等研究发现2D培养出的扁平状兔关节软骨细胞转入3D培养后，有80%的细胞恢复了原本的球状，在2D培养下出现的I型胶原和蛋白多糖异常分泌也恢复了正常。此外，3D培养法可改变2D培养下的基因表达。细胞的三维培养技术完全符合细胞科学的发展方向，强调并重视多技术的应用和多学科的协作。目前，为了更好地控制细胞培养过程中氧气和营养物质的供给以及代谢产物的及时排除，生物反应器以及生物活性支架材料是三维培养细胞的关键。鉴于三维培养系统日趋成熟以及其与人和动物的生理学研究方面的密切关系，使得设计和实现细胞间的共培养变得可能，并可以整合利用干细胞，从而更好地促进医学的发展。三维培养系统应用广泛，从组织工程到包括药物研究的临床试验都可应用。

（二）三维细胞培养技术的发展历史

自从40多年前真核细胞体外培养技术发明以来，由聚苯乙烯或是玻璃制作而来的支撑细胞生长的培养器皿已经为数以万计的实验提供了很好的二维培养细胞的平台。但是，动物体内复杂的生理学过程如何通过二维培养的单细胞层来准确再现并加以研究呢？显然，将细胞培养在由聚苯乙烯或是玻璃制成的二维培养器皿上并不能够精确地反映活体组织中细胞外基质的作用。因此，二维培养时许多复杂的生物学过程，如受体的表达、转录过程、细胞迁移以及细胞凋亡等都表现出与其来源的器官和组织完全不同。一个正常的细胞从分裂、增殖、迁移到凋亡的整个过程是受一系列复杂的内在因子精密控制的。二维培养模式太过于简单，忽略了许多对细胞生理过程非常重要的因素。这些因素包括机械压力刺激、细胞间以及细胞和细胞外基质间的相互作用。甚至二维培养对许多细胞内的作用也不能很清楚的阐释。为了解决上述二维细胞培养过程中存在的问题，更好地再现器官发育过程中的周围立体环境对细胞的作用，最大限度地模仿正常组织的发育和生长过程，三维培养模式由此而生。然而，伴随而来的则是要处理好支架材料、细胞来源以及相关细胞培养方法的选择与协调。

三维培养模式包括传统的组织块培养法、微载体培养法和组织工程模型等。并不是所有的三维培养模式都需要生物支架材料，支架材料的应用也是在过去的数十年间慢慢多了起来。目前利用上皮细胞来构建细胞膜片的方法研究也比较广泛。例如从人皮肤和黏膜中分离培养角化细胞，然后，将这些细胞接种培养在胶原胶、人工合成高分子材料以及去细胞的人表皮基质上。Feinburg团队利用人皮肤和口腔黏膜细胞，培养在人表皮基质上，可以很好地形成人工组织唇；而且，人表皮基质也已经用于临床上黏膜缺损的修复治疗等。三维培养的一个很重要的优势就是他们可以维持和保存许多细胞外基质成分如胶原（如Ⅳ型胶原）和蛋白等。基质中这些蛋白的保留可以显著增强移植细胞的黏附和增殖。

（三）三维细胞培养技术的分类

1. 需要支架类

主要是在三维空间内构建供细胞附着和生长的类似脚手架的多孔结构，细胞依附于支架进行三维生长和迁移，目前主要的支架材料为凝胶材料。

2D细胞培养的优势在于每个细胞均在同一平面生长，因此，每个细胞均享有同样的气体交换、营养供应及杂质清除。细胞易于检测、观察及收集。然而，3D细胞由于细胞间距及深度参差不齐，不利于常规显微镜的检测和观察，此外，3D培养下细胞也不能保证每个细胞均处于同一环境下生长。Alexander等将2D培养法易于观察和检测的优势及3D培养法良好微环境的优势结合在一起，设计了联合丙烯酸树脂（PAA）和琼脂糖凝胶作为支架的培养方法，该方法将每个HEK-293细胞包裹在琼脂糖凝胶中，固定于同一层，这种方法不仅保证细胞不接触器械底部，还可保证每个细胞独立不接触，从而避免因细胞黏附作用而团集成块。该培养方法的细胞倍增时间与2D培养法相同，克隆的细胞可用显微操纵的玻璃毛细管独立分离出来，利于后期提取和处理。通过调节PAA成分中丙烯酰胺和双丙烯酰胺的浓度比例来调节细胞在凝胶中的深度，影响细胞生理学特性。由于将细胞固定在同一层，因此，易于观察和检测。当前用于3D培养的人工或天然基质，只要可以固定细胞，均可替代琼脂糖凝胶，也可以向该凝胶中加入某种细胞所需要的必要成分，如ECM。细胞在固化3d后，其密度、形态学均未发生改变，当投入研究时，可不必考虑细胞间黏附性所带来的影响。因此，该技术培养下的细胞可用于长期研究及细胞间动力学。

2. 不需要支架类

主要是通过物理方法使贴壁细胞悬浮于培养基中以达到三维培养的目的，目前，主要的技术有微载体、磁悬浮、悬滴板和磁性三维生物印刷等技术。

2.1 胶原及人工合成聚合物

去细胞的胞外基质（dECM）现已成功用于组织工程支架中，胶原纳米纤维是dECM的主要组成成分。Li等将人工合成聚合物（PCL-BNF）纳米纤维成功模拟dECM中的胶原纤维的作用，并用于组织工程支架。常规的纳米纤维促进细胞分化的作用较大，然而促进增殖的作用却微乎其微。

支架的化学结构、生物功能、力学及结构都是决定细胞对支架反应的重要因素，Girish等研究发现支架的结构可决定细胞形态，每种支架纺织方法（SL，GFGFPS，FFF）所制造出的支架结构都可诱导出不同基因表达的骨髓间充质细胞，从而诱导出不同的细胞表型。

2.2 悬滴板

很多科学家不喜欢用支架，而是喜欢将细胞悬浮在溶液中，迫使细胞自动变为球状，这些细胞相互黏附，但并不触及塑料底面。通常使用的方法是用移液管将液滴移到有盖培养皿的盖的下方，当盖子置于培养皿上时，细胞就处在了液滴的下方。这种方法的缺点在于换培养液时必须将液滴弹下来并收集起来，这时液体就很容易扩散、融合及蒸发。Tung等设计了一个特别的板子，该板子的顶部有很多孔，可以将液滴种在每个孔的顶部，以便收集，在研究抗肿瘤药物5-FU作用中，相比2D培养法，其具有更好的抗增殖作用。该方法多于研究肿瘤细胞趋化因子。

2.3 磁悬浮法

磁悬浮法是将称作纳米梭的氧化铁纳米粒子置于细胞中，然后，在培养皿中放置一块磁铁，依靠磁力将细胞悬浮，并将细胞变成球状或其他形状，这种磁力又被称为看不见的支架。Hamsa等用磁悬浮法成功模拟了异构乳腺肿瘤在体内的微环境，并在24h内成功成瘤，不仅可以控制肿瘤的成分，还可控制其密度。磁悬浮法常用于控制细胞形态，构建宏观结构的实验。

2.4 微重力法

微重力法模拟一小片组织，血液流动在其中。每个流动单位固定在96孔板的3个相邻的孔中，细胞置于中间的孔，浸润在凝胶中，环绕着被称为仿造上皮屏障的硅凝胶膜。旋转细胞培养系统（rotarycellculture system，RCCS）是一种颠覆传统的三度空间微重力培养系统。其利用培养盘或培养管柱进行培养，将培养液、细胞或组织一起加入培养盘或培养管柱中，并去除所有气泡。培养盘或培养管柱安装于旋转马达的基座上，内部组织、细胞或细胞团块因旋转切线力量及重力双重影响下而保持悬浮状态。随着细胞或组织成长，旋转速度可做调整，细胞形成团块之后，必须提高转速使其不会沉降而碰触底部。旋转的目的是要让所有细胞均匀交换养分和气体，并且细胞和细胞之间可有足够的接触，有利于细胞聚集。生长其中的细胞或组织是以自由落体的状态悬浮，没有搅拌器、气泡等破坏性压力，故组织在培养液中得以自由降落、翻转并与培养液充分混合，其容器内各方向的力量达到平衡，所以细胞/组织不会受到单一方向的力量影响，可朝任意方向均匀生长，是市面上唯一可使细胞自由生长分化，增加细胞增殖速率，减少细胞死亡和有效增加细胞产物分泌的系统。相比其他的三维细胞培养系统，Synthecon的RCCS系统可以克服长期困扰三维细胞培养的内生（ingrowth）不足的限制，从而可以真正用来培养工程组织（engineered tissue），使之用于药物、医学研究及再生医学、细胞疗法。Caterina等研究发现，相比2D培养法，RCCS法培养的细胞可增加特异性分化标记物的表达。