上皮细胞培养一直受到人们的重视，这是因为许多器官的上皮细胞具有特定的功能，如肾和肠道上皮细胞的吸收功能肝和胰上皮细胞的分泌功能，肺上皮细胞的气体交换功能。某些上皮细胞（如角化上皮细胞）可作为研究细胞分化和细胞动力学的模型。上皮细胞培养中最大的困难是成纤维细胞往往过度生长，而上皮细胞在体外培养中难以长期生存。为此需要从表皮分离、培养液和基质选择、增减适当的生长因子等方面抑制成纤维细胞生长促进上皮细胞的生长。

1. 表皮细胞

概述

在人和动物体内，表皮细胞生长在胶原基质膜上，并从基质膜获取生长分化所需要的物质。目前表皮细胞的体外培养较为成熟的技术是以Rheinwald和Creen（1975）创立的方法为基础发展起来的饲养层细胞培养法，要点是以小鼠3T3细胞作为表皮细胞的饲养层，并使用含胎牛血清的培养液。在体外培养条件下，可用冷胰蛋白酶消化法使表皮与真皮分开，由于组织标本及培养温度的不同，有时分离面可能一部分低于而另一部分高于基底层细胞；将真皮层用酶消化、吸管吹打、过筛分离法可获得单个细胞。

原代或有限传代培养动物和人皮肤角化上皮细胞需要使用某些基质、培养液及包括饲养层在内的一些添加物。在正常Ca²⁺浓度（1.4mmol/L）情况下可形成分化的复层生长细胞，在低Ca²⁺浓度（低于1.0mmol/L）下，则成为分化的单层生长的细胞；有充足饲养细胞（如3T3）时，有助于减少混杂的成纤维细胞。此外，降低pH值、添加适量霍乱毒素、去甲肾上腺素及表皮生长因子（EGF）均有利于表皮细胞生长。下面以皮肤表皮细胞为例叙述上皮细胞的培养方法。

用品

（1）培养液：

①含有4倍浓缩维生素及氨基酸的Tangle's MEM(4xMEM)，加有热灭活的15%胎牛血清（FBS）或20%的小牛血清。

②与上相同的4xMEM，加无Ca²⁺的Hanks平衡盐液（HBSS）以及经chelex（Hennings等，1980）处理的FBS，用CaCl₂调整Ca²⁺浓度，用于鼠表皮细胞培养时，Ca²⁺浓度为0.08mmol/L，用于人表皮细胞时则为0.22mmol/L。

③FAD培养液，组成为1份F12和3份DMEM，并加入腺嘌呤1.8x10^-4mol/L、霍乱毒素1x10^-10mol/L、表皮生长因子（EGF）10ng/mL、氢化可的松0.4ɥg/mL和5%FBS。

④MCDB153无血清培养基：MCDB153为基础，胰岛素5mg/L、氢化可的松0.5mg/L、人转铁蛋白1mg/L、EGF10μg/L、牛垂体提取液50mg/L、乙醇胺1x10^-3mol/L。

⑤上皮细胞培养液：近年来，国外些公司研制了多种成品上皮细胞培养液，例如使用于角化上皮细胞的KGM适用于一般表皮细胞的EGM等，使用很方便。

⑥3T3细胞培养液：DMEM培养基添加10%胎牛血清，4mmol/L谷氨酰胺。培养液可含有抗生素，包括青霉素100U/mL，链霉素100ɥg/mL，二性霉素0.25mg/L。

（2）0.2%或0.25%胰蛋白酶（1:250）。

（3）0.25%分离酶（dispaseⅡ）：主要作用在表皮-真皮结合处，在表皮细胞分离过程中，可获得大量具有增殖能力的基底细胞，而且可以减少成纤维细胞的污染。

（4）HBSS、DBSS（HBSS+抗生素）、PBSA（无Ca²⁺、Mg²⁺的PBS）。

（5）重组表皮生长因子10ɥg/L、0.01%的胶原蛋白（表皮细胞贴壁剂）。

（6）丝裂霉素C：浓度为400ɥg/mL溶于双蒸水中，4℃避光保存。

（7）饲养层细胞：为源于小鼠胚胎瘤的成纤维细胞系3T3细胞，可促进表皮细胞的贴壁与生长，并抑制成纤维细胞的生长。

（8）手术刀、弯钳、10cm培养皿培养瓶等。

步骤

（1）无菌条件下切取皮肤标本，用DBSS冲洗3~5遍，在冲洗过程中至少更换器械1次。

（2）将标本的上皮面朝下放入干燥的培养皿中，加数滴PBS使之湿润，用弯剪尽可能除净皮下脂肪和疏松结缔组织，只留下表皮和下方的致密结缔组织，并将标本切成大约1cmx2cm的小块，以便酶能充分作用于上皮与间质交界区。

（3）用无Ca²⁺、Mg²⁺的PBS冲洗标本3~5遍，将标本放入0℃~4℃的0.2%或0.25%粗制胰蛋白酶（1:250）溶液中（用无Ca²⁺、Mg²⁺的PBS配制：pH7.2），或浸入0.25%DispaseⅡ中。通常用10～15ml胰蛋白酶液浸泡8个标本块，容器为直径10cm的塑料平皿，在无菌条件下4℃冰箱中放置15～48h，如果在37℃孵箱中培养时间须控制在1～3h，以免细胞被胰蛋白酶损伤。

（4）表皮层与真皮层分离时，表皮层为浅棕色，真皮层为白色，观察到标本边缘表皮与真皮分离时将其移入另一10cm塑料平皿，真皮表面向下用5mL含血清完全培养液冲洗，用两个弯镊轻轻地将表皮剥脱，放入含20mL培养液的50mL离心管中，用吸管反复吹打，过100目尼龙筛，使角化上皮细胞分离。

（5）用弯钳在剩余的真皮标本表面（上皮面）轻轻刮除附着不牢固的基层细胞，把从真皮和表皮层表面分离到的细胞混合，用培养液洗2次（离心法，100g，10min），过滤，台盼蓝染色法行活细胞计数，活细胞达90%以上用于培养成功率较高。

（6）饲养细胞的制备：在已形成单层的3T3细胞培养瓶或培养板中加入丝裂霉素C1~10ɥg/mL，使3T3细胞不再分裂增殖，即可作为表皮细胞的黏附饲养细胞。亦可将3T3细胞维持在低密度条件下培养，照射处理后作饲养层。具体方法为将胰蛋白酶消化的3T3细胞悬浮于含10%胎牛血清的MEM培养液中，在75cm²培养瓶中接种1.5x10⁶个细胞，在钴源下给予60Gy照射剂量，培养细胞贴壁（约需4～12h）后更换培养液待用。

（7）黏壁剂包被：用0.01%胶原蛋白铺于培养瓶或培养板的底部，过夜，弃上清，40℃干燥箱内烘干，制成胶原蛋白黏附膜，紫外线照射2h消毒备用。

（8）以每平方厘米（1~5）x10⁵个细胞的密度接种在含适量培养液①或③中，37℃培养箱内静置1～3d，细胞贴壁后，冲洗细胞层以去除未贴壁的细胞，将已贴壁的细胞继续培养在培养液①或③中，长期生长可形成复层细胞，如果换到培养液②中，在低Ca²⁺浓度下呈单层生长。

（9）表皮细胞的传代培养：传代培养于①或③培养液时，先用0.05%～0.1%的EDTA孵育10～30min，使细胞逐渐变圆，细胞间隙增大，后用0.1%的胰蛋白酶和0.05%EDTA消化，吸管吹打使细胞完全脱壁。如果传代培养于培养液②中仅用0.1%的胰蛋白酶和0.05%EDTA消化即可。

（10）直接使用上皮细胞培养液。在培养过程中可加入表皮细胞生长因子10ng/mL、牛垂体提取物50mg/L、乙醇胺10^-3mol/L。也可用淋巴细胞分离液分离表皮细胞和成纤维细胞，根据比重差异离心后可获得纯度高、增殖快的表皮细胞。

操作提示

（1）表皮细胞培养的难点是排除间质细胞的污染，使用饲养层3T3细胞培养法有助于减少混杂的成纤维细胞。

（2）0.25%DispaseⅡ分离表皮层，吹打分散细胞困难时，可用胶原酶进一步消化分散，可以获得更多的表皮细胞。

（3）可使用低温冻存细胞的方法保存大量同批组织标本分离得到的细胞，取融合前的原代培养细胞进行冻存效果最好。

结果及鉴定

表皮细胞培养3～5d后可于相差显微镜下观察到增殖形成集落，并向四周扩展，约10d时增殖的表皮细胞集落开始汇合，继续培养可形成整片细胞，同时细胞增殖减慢，可传代培养。

表皮细胞对角蛋白单克隆抗体反应阳性，对波形丝单克隆抗体反应阴性。