乳腺主要由腺上皮组成。早期乳汁或断奶后的乳汁含有上皮细胞团块，可用离心法收集其中的细胞，乳房成形术可提供合适的标本进行正常乳腺导管上皮细胞的培养，用长满的人胚胎小肠纤维细胞饲养层可抑制间质细胞的生长，使用优化培养液可使培养的上皮细胞传代，并形成克隆。如将细胞培养在胶原凝胶上，则可形成三维立体结构，并与起源的供体组织相似。胰岛素、氢化可的松、霍乱毒素EGF等可促进上皮细胞生长，在器官培养中，乳腺腺泡上皮的分化需要氢化可的松、胰岛素和催乳激素，在细胞培养中还需雌激素、黄体酮等。体外培养中的乳腺上皮细胞具有乳腺细胞的功能，可用于确定免疫标记物类型，这些细胞可被SV40病毒转化，是研究正常乳腺细胞与乳腺癌细胞的区别以及癌基因引起细胞转化的重要材料。下面介绍用乳汁和乳腺组织块法培养乳腺上皮细胞的方法。

一、 乳汁法

概述

人早期乳汁或断奶后的乳汁含有上皮细胞团块，可用离心法收集其中的细胞用于体外培养。

用品

（1）人血清。

（2）储存液：①胰岛素1mg/mL，溶于6mmol/的盐酸；②氢化可的松0.5mg/mL溶于生理盐水；③霍乱毒素50μg/mL溶于生理盐水。

（3）胰岛素、氢化可的松、霍乱毒素、胰蛋白酶以及储存液存放于-20℃。

（4）消化液：含胰蛋白酶0.14%,EDTA 0.29%。

（5）培养液：RPMI1640、15%FBS、10%人血清、50ng/mL霍乱毒素、0.5ug/ml氢化可的松、1μg/mL胰岛素。

步骤

（1）乳汁收集方法：于产后2～7d在病房收集。用无菌水擦洗乳头，手法压迫使乳汁流入无菌容器，从每人中获取5～20ml，用RPMI 1640培养液按1:1比例稀释以利于离心。

（2）离心，600~1000r/min，20min，去除上清。

（3）用含5%FBS的RPMI1640培养液清洗细胞团块2～4次直到上清液不混浊为止。

（4）将50ɥL离心所得细胞混悬在6mL培养液中，接种于1个6cm培养皿，37℃、5%CO_2，孵箱中培养。

（5）3～5d时更换培养液，以后每周换液2次，大约6～8d时可见克隆形成并且逐渐扩大，起初可见有饲养作用的巨噬细胞，以后逐渐消失。

（6）乳腺细胞的传代培养：细胞长满后，用消化液消化5～15min（每个6cm培养皿用消化液1.5mL），消化产生单细胞悬液，洗去消化液，3倍稀释后重新接种培养。

二、组织块法

概述

用乳腺组织培养上皮细胞时，需首先尽可能剥除脂肪组织，如果标本中含纤维组织较多，可用胶原酶消化法获取细胞。经照射或用丝裂霉素处理过的3T3细胞具有很好的促生长作用；cAMP可代替霍乱毒素刺激上皮细胞的生长；如果在培养器皿底壁上铺以胶原层，既利于腺细胞生长，也利于细胞从底面上分离。

用品

（1）妊娠小鼠乳腺组织

（2）培养液及添加物：F12基础培养液、5%热灭活胎牛血清、氢化可的松1ɥg/ml、胰岛素1ɥg/mL、青霉素100U/mL、链霉素100ɥg/mL、人重组表皮生长因子10.0ng/mL等。

（3）弯镊、弯钳、手术剪、外科手术刀等。

（4）培养板：用生长基质包被培养板，如血清或胶原。

（5）胶原酶溶液：3.0mg/mL胶原酶A、2.6mg/mL Hepes、1.2mg/mL,NaHC0₃、1.5mg/mL胰蛋白酶、9.8mg/ml Ham's F10和5%胎牛血清，调整pH至7.4，过滤除菌备用。

（6）胰蛋白酶/EDTA混合消化液：储备液为5.0mg/mL胰蛋白酶溶于HBSS/EDTA液中制备成10x胰蛋白酶/EDTA混合消化液，工作浓度为0.5mg/mL。

步骤

（1）取乳腺组织约5g，用手术剪剪切乳腺组织使其成糊状。

（2）将剪切的乳腺组织放入三角烧杯中，加入胶原酶溶液（5mL/g），37℃下以200r/min消化1h，此过程可重复若干次直至完全消化。

（3）收集沉淀的细胞团块，主要为腺泡样细胞团块。用F12培养基离心洗涤三次，重新悬浮细胞团块，

（4）细胞计数：大约每克组织中可获得（5~15）x10⁶个细胞。

（5）用2x接种培养基（F12基础培养液中添加氢化可的松2μg/mL、胰岛素10μg/mL、青霉素200U/mL、链霉素200μg/mL、人重组表皮生长因子10ng/mL、庆大霉素10μg/mL）重新悬浮细胞团块滴加在预先血清（血清和胎球蛋白混合液）包被的培养器皿中，接种密度为（2.5~5.0）x10⁵/cm²，在37℃、5%CO₂培养孵箱中培养48h。

（6）更换培养基为生长培养基（F12基础培养液中添加氢化可的松1ɥg/mL、5%热灭活胎牛血清、胰岛素5μg/mL、青霉素100U/mL、链霉素100μg/mL、人重组表皮生长因子5ng/mL、50μg/mL庆大霉素）继续培养，每2d更换1次培养液。

操作提示

（1）用乳腺组织培养上皮细胞时，需首先尽可能剥除脂肪组织。

（2）最好使用胶原酶进行初步消化分离。

（3）利用3T3饲养层细胞培养法具有很好的促生长作用。

（4）在培养器皿底壁上铺以胶原层有利于腺细胞生长，也利于细胞从底面上分离。

结果及鉴定

乳腺细胞团块和导管细胞团块可在12h内贴壁，接种48h后细胞可从细胞团块中迁移伸展出来，大约4d可形成90%～95%细胞汇合的单层细胞，第5天细胞可长满培养器皿底面。

免疫组化染色角蛋白阳性（主要为角蛋白7、8、18），肌动蛋白阳性，细胞表面抗原CD10等阳性。