流式细胞术检测细胞凋亡（Annexin V/PI法）是一种基于生物学功能的检测方法，通过结合使用Annexin V和PI两种染料来区分不同凋亡阶段的细胞。Annexin V是一种磷脂结合蛋白，能特异性地与早期凋亡细胞外翻的磷脂酰丝氨酸结合，而PI是一种核酸染料，能透过凋亡中晚期及坏死细胞的细胞膜将细胞核染红。将两者联合使用，流式细胞仪可以区分出活细胞（Annexin V-/PI-）、早期凋亡细胞（Annexin V+/PI-）、晚期凋亡细胞和坏死细胞（Annexin V+/PI+），从而准确检测细胞凋亡情况。

实验步骤

1、染色前处理

1.1将收集到的细胞，用预冷1× PBS (4 °C) 重悬一次，300 × g , 离心5分钟，弃上清，收集细胞。

1.2   加入300 μl的1× Binding Buffer重悬细胞，调整细胞浓度至1 × 106/ml。
2、Annexin V/PI染色

2.1取流式管，按顺序编好空白管，单阳管和样本管号。流式管中分别加入经200目细胞过滤膜过滤好的100 μl细胞悬液，单阳管中分别加入5 μl Annexin V-Alexa Fluor™488或10μl PI碘化丙啶轻轻混匀。

2.2样本管加入5 μl Annexin V-Alexa Fluor™488轻轻混匀；再加入10 μl PI碘化丙啶轻轻混匀。

2.3室温避光孵育10~20分钟，加入400 μl 1× Binding Buffer，随后置于冰浴中，上机检测，所选通道如下：
Alexa Fluor™488：488 nm激发，采集波段530/30；PI：561 nm激发，采集波段610/20。

结果与分析

图1. 前向 (FSC) 和侧向 (SSC) 圈出HeLa细胞

图2. Annexin V/PI双标记HeLa细胞凋亡检测

如图1所示通过前向 (FSC) 和侧向 (SSC)，分别圈出的对照组和H₂O₂诱导组的HeLa细胞范围有所差别。诱导凋亡组的细胞已呈现出分群的趋势。

图2为Annexin V/PI双标记的结果，如图2A所示对照组的HeLa细胞处于正常状态，但也有少许凋亡晚期的细胞，原因是培养的HeLa细胞浓度过高，导致培养基里的营养消耗过快，少许细胞因饥饿发生凋亡。图2B中显示，经H₂O₂诱导HeLa细胞出现了显著的早期凋亡现象，比例由1.06%增至7.43%；凋亡晚期的细胞比例呈明显增长趋势。

综上可知，双标记方法可以准确地反映凋亡过程：Annexin V标记的单阳性细胞为凋亡早期细胞；Annexin V 与PI双标记的双阳性细胞为凋亡晚期细胞 (Koç,等，2018)；PI标记的单阳性细胞为坏死细胞；两者均未标记上的双阴性细胞为活细胞。由此将凋亡早期细胞、凋亡晚期细胞、坏死细胞与正常细胞区别开。因此，可作为检测细胞凋亡的首选方法 。

注意事项

1、使用前低速离心，以免液体积存管盖和管壁。

2、如果用含EDTA的胰酶消化时，注意必须彻底清除EDTA:在标记前用1×PBS或1×Bindingbuffer洗涤，清除EDTA,以免残余的EDTA与Ca2+螯合，影响AnnexinV的结合。

3、Annexin V-Alexa FluorTM488和PI是光敏物质，在操作时请注意避光。在处理和标记时，尽可能在暗处进行。在孵育阶段，用铝箔包裹容器或置于抽屉中。细胞标记后，在暗室内用显微镜观察。

4、整个操作过程动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞，尽量在4℃下操作，以免影响细胞状态。

5、在细胞洗涤的最后一步，请尽量将上清弃净，以免PBS残留，有可能会影响实验结果。

6、为防止荧光衰变，宜在1小时内进行流式检测。

7、PI染色时间过长有可能造成检测的凋亡率偏高，建议首先进行Annexin V-Alexa FluorIM488染色，最短可在上机前5分钟再加入PI染色。