巨噬细胞存在于机体各组织器官中，具有典型的功能表型异质性。巨噬细胞除了参与免疫防御与调控之外，还在组织稳态构建、生长发育、体温调节等多种生命活动中扮演关键角色。巨噬细胞是信号感受器（Sensor/Controller）与功能效应器（Plants），在响应外界复杂信号时，巨噬细胞可启动特定的分子级联反应，实现表型与功能的切换，以适应组织、器官功能运行的需求。因此，巨噬细胞在基因表达谱、分化途径及功能性极化等多层面体现其复杂的异质性。

流式细胞术是一种用于检测肿瘤微环境内巨噬细胞极化状态的重要技术。在肿瘤微环境中，巨噬细胞可以根据其表型和功能被分为M1型和M2型。M1型巨噬细胞具有促进炎症和抗肿瘤活性的特性，而M2型巨噬细胞则与免疫抑制、组织修复和促进肿瘤生长相关。

图1.肿瘤微环境内巨噬细胞极化的流式检测结果

 实验步骤

1. 前期准备工作
1.1 分组标记：

根据实验分组需求取若干六孔板，标记荷瘤小鼠信息。六孔板中每孔加入3 ml DMEM高糖培养基，将六孔板置于冰上待用。
1.2 配制肿瘤组织消化液：

将预先配制的100× 消化液母液 (含100 mg/ml胶原酶I和20 mg/ml DNA酶I) 用含5% FBS的DMEM高糖培养基稀释100倍，即最终工作浓度为1 mg/ml胶原酶I和200 μg/ml DNA酶I。将1× 消化液置于37 °C水浴锅预热待用。
1.3 器械准备：

根据实验分组需求准备适量的剪刀镊子，用双蒸水洗净后75%乙醇消毒，烘干备用。
2. 肿瘤组织的分离
  采用颈椎脱臼法将荷瘤小鼠处死，喷洒75%乙醇消毒。左手持弯镊，右手持剪刀在肿瘤右侧1 cm处沿肿瘤边缘剪开一长约2 cm口子。左手捏住剪开处的皮肤向外翻折，可清晰见到肿瘤附着于皮下。用剪刀沿肿瘤边缘轻轻剪开，将肿瘤剥离，注意肿瘤若有溃烂，则避开溃烂之处。将剥离下来的肿瘤组织放入预先准备好的六孔板内。
3. 肿瘤组织的剪碎
  待全部肿瘤剥离完毕，用移液枪吸出预留DMEM高糖培养基，余大约0.1 ml，以免在剪碎过程中肿瘤组织干燥。手持剪刀小幅度高频率剪碎肿瘤组织，将肿瘤组织剪成泥浆状，肉眼无法看见清晰组织块。注意以上步骤均在冰上操作。
4. 肿瘤组织的消化
  将肿瘤组织剪成泥浆状后，每孔加入2 ml 1× 消化液，用1 ml枪头将肿瘤组织碎末打散，置于37 °C恒温细胞培养箱消化30 min，每隔10 min将六孔板取出晃动混匀一次。注意严格按照时间消化，以免影响免疫细胞活性。可根据肿瘤大小调整1× 消化液的用量。
5. 制备肿瘤细胞悬液

消化完毕后，将六孔板取出放于冰板上，每孔加入4 ml DMEM高糖培养基 (含5% FBS) 终止消化。用巴氏吸管吸取肿瘤组织悬液至70 μm细胞滤网过滤，同时用1 ml注射器后部研磨遗留在滤网上的组织块 ( 注意研磨时切勿用力，易将脂肪等带入细胞悬液中 )，用DMEM高糖基础培养基冲洗滤网上的组织块，所得肿瘤悬液4 °C，850 x g，离心5 min。

6.染色前封闭

由于髓系细胞表面表达较多Fc受体，容易对流式抗体有非特异性结合，故采用预先阻断Fc受体封闭。离心后弃上

清，根据沉淀多少加入适量FACS缓冲液混匀，取10 μl细胞悬液计数，将悬液细胞密度调至2×107个/ml。取100μl细胞悬液于U底96孔内，按100:3比例加入抗Fc受体抗体(即每100μl细胞悬液加入3μl抗Fc受体抗体),4℃孵育30 min。

7.配制流式染色抗体

按照表1配制流式抗体混合液(用FACS缓冲液配制),每孔加入70μl流式抗体混合液，根据需要计算每个流式抗体所需体积。

注：由于F4/80、MHCII、CD86、CD206染色均显示漂移，没有明显分群，需要额外增加空白对照(不加相应的流式抗体)和荧光扣除对照(加入与相应流式抗体一样的只带荧光的流式抗体)。以anti-mouse-CD206-PE为例，空白对照即不加CD206-PE这。流式抗体，而荧光扣除对照则是添加anti-rat-IgG-PE。

声明：本文使用图片大部分来源于网络和文献，如有侵权请联系删除。