概述

子宫颈上皮细胞体外培养在细胞分化、癌前病变及癌的研究中有重要意义。由于子宫颈直接暴露于阴道，取材时要特别注意防止污染。原代培养用组织块法，传代培养需要经照射过的3T3细胞作饲养层，培养液中需要适当的添加物。

用品

（1）平衡盐溶液BSS。

（2）消化液：0.1%胰蛋白酶、0.01%EDTA溶于PBSA。

（3）传递用培养液：LeibovitzLl5含FBS10%、氢化可的松0.5ɥg/mL、青霉素50U/mL、链霉素50ɥg/mL。

（4）原代培养的促生长培养液：Lei-bovitzL15含FBS10%、氢化可的松0.05ɥg/mL、青霉素50U/mL、链霉素50ɥg/mL、霍乱毒素6ng/mL。接种的组织块贴壁后加入EGF5ng/mL。

（5）EGF储存液：1004ɥg EGF溶于5ml无菌蒸馏水，用时稀释至1ɥg/mL。霍乱毒素储存液：分子量60000，6ɥg/mL，溶于生理盐水。氢化可的松储存液：25mg加3mL纯乙醇，再加入47mL蒸馏水，过滤除菌，分装，避光储存。

（6）3T3细胞、MEM+100% FBS（在照射过的3T3细胞上生长的上皮细胞所需培养液）

（7）蚊式血管钳、解剖刀、滴管、通用容器或圆锥形离心管、25cm²和75cm²的培养瓶、6~9cm²培养皿。

（8）⁶⁰Co放射源。

步骤

（1）收集活检标本，放入传递液中，可在4℃存放1～4d，尽快进行培养为好。

（2）用5个9cm培养皿，在3个皿中分别加入15 mL BSS，第4皿中加5mL，第5皿不加。

（3）将标本移入空皿，用BSS淋洗；移入第1个含BSS的皿中，洗涤；移入第2个含BSS的皿中，用两个带有剃须刀片的解剖刀，小心分离标本上的纤维组织；移入第3个含BSS的皿中，洗涤。移入第4个含BSS的皿，开始切碎；组织块较小时移入第5个皿，在皿的干燥部分操作比较容易，尽量切整齐，避免撕拉，将组织块切至直径2mm大小为止，用BSS湿润组织块。

（4）用滴管将组织块移入盛有BSS的通用容器或离心管（勿使组织块黏附在内壁上），待组织块自行沉降。吸除上清液，加入10～15mL新鲜的BSS，待组织块自行沉降。用培养液重复洗1次。

（5）吸除培养液，加入1mL新鲜培养液。准备2～4个25cm²培养瓶，每瓶加入2.5mL培养液、然后加入0.25mL含有大约10个组织碎块的培养液。

（6）37℃培养至组织块贴壁，大约需10d。加入EGF使终浓度为5ng/mL如果许多细胞从组织块游出，用含ECF的培养液换液。

（7）继续培养3～4d，使细胞长满1/2~2/3培养瓶底壁，此时可传代培养：对原代培养物进行消化，先用平衡盐液洗1遍，加2.5mL0.1%胰蛋白酶和0.01%EDTA混合液，1min后除去消化液37℃培养至细胞脱壁；用培养液悬浮细胞，计数；在铺有⁶⁰Co射线照射过的3T3细胞的培养瓶中接种子宫颈上皮细胞，如用25cm²培养瓶，每瓶接种约10⁴个细胞每3～4d换液1次，细胞长满时传代培养于新照射过的3T3细胞上

操作提示

（1）原代培养时既可选择3T3饲养层细胞培养法，也可在无饲养层条件下用无血清角化细胞培养液（KGM）进行培养。传代时需用3T3饲养层传代。

（2）获得的上皮细胞可液氮冻存备用。

（3）用中间丝单抗进行免疫组化鉴定，角蛋白阳性，波形丝阴性。