概述

口腔黏膜缺损修复往往需要适合的移植材料以满足创伤愈合和恢复口腔功能；可用的口腔黏膜组织的缺失又限制了外科医生修复缺损。虽然有皮肤移植用于修复黏膜缺损，但有其缺点。比如说皮肤包含毛囊、汗腺等许多附属结构，而且皮肤和黏膜也有不同的角化程度。近年来有研究在适宜的支架材料和生物活性因子的刺激下培养人来源的细胞，构建组织工程化的黏膜组织等。Feinberg教授等成功培养的组织工程口腔黏膜（exvivo produced oralmucosa equivalent，EVPOME），可用于治疗口腔黏膜缺损。下面就简要介绍下口腔黏膜细胞的分离和培养方法，以使大家能对口腔黏膜细胞的培养和口腔黏膜缺损的修复治疗有一定的了解。

用品

（1）#10手术刀，镊子，细胞培养皿（35mm，60mm，100mm，150mm），吸管（5ml，10mL，25mL），细胞培养瓶（T-25，T-75），离心管（15mL,50mL），100ɥm的滤网，巴氏吸管。

（2）PBS，0.25%胰蛋白酶，胰蛋白酶抑制剂（DTI，Iife technologies），台盼蓝，抗生素（包括抗真菌药），EpiLife角化细胞培养基，EDGS。

（3）血细胞计数仪，倒置显微镜等。

步骤

（1）第1天：口腔黏膜组织样本的清洗。

①无菌条件下切取口腔黏膜，修剪除去肉眼可见的黏膜下组织，置于含10%血清的DMEM。用PBS洗净血迹2.5g/L氯己定液浸泡5～8min，切成0.3cmx1cm大小的组织块。

②用PBS稀释0.25%的胰蛋白酶浓度为0.04%。

③将获得的口腔黏膜组织放进含有氯化钙的5mL(15mL)Epilife 基础培养基的15mL（50m，根据黏膜组织的大小而定）离心管中，保存于4℃的冰箱中。

④将上述黏膜组织和培养基的混合液移入60mm（100mm）的培养皿中。

⑤添加含有氯化钙的3ml(8ml)EpiLife基础培养基到35mm（60mm）的培养皿中。

⑥用血管钳和镊子仔细去除黏膜上残存的血管组织等。然后转移到35mm的培养皿中。

⑦重复上述步骤3次。

⑧转移去除血管后的黏膜组织到另一个35mm的培养皿中直到准备用0.04%的胰蛋白酶完全浸泡。

⑨添加适量的0.04%的胰蛋白酶到35mm（60mm）培养皿中，添加抗生素。

⑩转移黏膜组织到0.04%的胰蛋白酶溶液中，盖上盖子。

⑪置培养皿于超净工作台中16±1h；根据开始后续步骤的计划，可以适当调整浸泡的时间。

（2）第2天：口腔角质形成细胞分离与接种。

①添加10mL的胰蛋白酶抑制剂到60mm的培养皿中，添加8mL的EpiLife完全培养基（包括EDGS，氯化钙，抗生素和抗真菌试剂等）到该培养皿的盖子中。

②转移已消化的黏膜组织到培养皿中。

③用无菌镊子夹住黏膜组织，用#10刀片轻轻揭去上皮细胞层，基底层细胞被揭起后放入胰蛋白酶抑制剂中。

④转移揭起的组织到同一个培养皿的盖子中。必要时重复上述步骤

⑤置一个100µm的滤网在50ml离心管的开口处。

⑥使用10mL的吸管，将消化液过滤到离心管中。

⑦使用同一个吸管，利用4mL EpiLie完全培养基清洗培养皿底，同样的方法过滤。

⑧再用4mLEpiLife完全培养基重复上述步骤。

⑨浸泡过夜后丢弃黏膜下层组织到生物废物垃圾桶中，或用适宜的方法获取口腔黏膜成纤维细胞。

⑩在50mL离心管的瓶口处轻轻震荡滤网，以最大限度获得分离的细胞。

⑪震荡离心管后，吸取15µL的细胞悬液，再添加15µL的台盼蓝溶液后，吸取10µL的重悬的细胞到血细胞计数仪上计数，倒置显微镜下观察并计数。

⑫盖紧离心管盖子，800r/min，离心3min。

⑬用吸管轻轻去除上清液，注意不要碰触到底层的细胞沉淀。

⑭用5m的EpiLife完全培养基重悬细胞沉淀。

⑮接种5.0x10⁶个细胞到T-25的培养瓶中，如果获取的细胞数目在5.0x10⁶~15.0x10⁶，则将细胞接种在T-75的培养瓶中。

⑯隔天换培养液一次。此时的细胞标记为P₀细胞。

⑰当细胞汇合到70%左右时，消化传代。

⑱用PBS稀释0.05%的胰蛋白酶为浓度为0.025%胰蛋白酶/EDTA溶液。

⑲使用10mL的吸管吸取组织培养瓶的培养基到另一个无菌的50ml的离心管中。

⑳添加2mL的0.025%胰蛋白酶/EDTA溶液到T-25培养瓶；4mL 0.025%胰蛋白酶/EDTA溶液到T-75养瓶或8mL 0.025%胰蛋白酶/EDTA溶液到T-150的培养瓶。

㉑盖紧盖子，孵箱中孵育8～12min。

㉒8min后，观察细胞是否从培养瓶表面分离，轻轻震荡后在倒置显微镜下观察；如果没有分离完全，则继续消化几分钟。

㉓待消化完毕后，添加同量的胰蛋白酶抑制剂到培养瓶中。

㉔吸取消化液到另一个50mL的离心管中。

㉕用提前吸出来的培养基清洗培养瓶中，也一并移入离心管中。

㉖轻轻震荡后，计数所获得细胞。

㉗盖紧盖子，置离心管于离心机中并配平。

㉘200g室温离心3～5min。

㉙丢弃上清液，注意不要碰触到下层的细胞沉淀。

㉚基于前述的细胞计数结果，接种密度为（0.7~1.3）x10⁴/cm²。比如说，T-25的培养瓶则每瓶接种0.25x10⁶个细胞。

㉛细胞沉淀重悬后，接种；隔天换培养液一次。

操作提示

如口腔黏膜上皮来源于活检取材，在开始培养的3～4d内使用含抗生素的培养液。口腔黏膜角质形成细胞的分选可选择荧光激活细胞分选法（uorescence acti-vated cell sorting, FACS）。

结果及鉴定

刚获取的细胞形态呈多样性，为多角形扁平细胞、体积较大的球形细胞和体积较小的球形细胞。细胞接种后32～96h贴壁，为折光性强的圆形细胞。随后细胞逐渐伸出短小伪足，胞质展开，折光性减低。完全伸展的细胞呈扁平多边形，胞核清晰，细胞大小是伸展前的2~3倍。此时核分裂象少见。接种5d后细胞加速增殖，核分裂象多见，细胞数量明显增多细胞逐渐生长融合成片，呈大小均一的铺路石状。培养2周左右细胞接近融合。培养过程中细胞还表现出一定的分化现象，在低密度培养时尤其明显。

免疫组织化学检测角蛋白阳性，波形丝蛋白阴性。透射电镜下，胞核大，卵圆形；胞质内见正常细胞器，含大量的张力纤维，网状或束状排列；细胞之间有丰富的桥粒结构。扫描电镜下见细胞呈镶嵌状排列，表面可见微绒毛和胞质皱褶。偶见胞质回缩的球形细胞，表面微绒毛丰富。