概述

胆管和胆囊上皮细胞的分离、纯化相对比较容易，一般只需胶原酶消化，再经密度梯度离心或免疫磁珠等方法分离，即可获取大量高纯度的上皮细胞。但是，胆管上皮细胞在体外生长维持时间短，易失去增殖能力。

用品

（1）2~3月龄的家兔胆囊。

（2）常用的培养基有：DMEM、DMEM/F12、RPMI1640、BDCM（bile-duct conditioned medium）等。

（3）0.125%Ⅳ型胶原酶溶液。

（4）常用的添加剂：内皮细胞生长因子、三碘甲状腺素、转铁蛋白、霍乱毒素、腺嘌呤、L-脯氨酸等。肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor,HGF）对胆管上皮细胞具有更强的促增殖作用，可使细胞增殖保持到3～5个月，细胞数可增加100万倍，且可连续培养7~9代也可在液氮中冷冻保存。

（5）饲养层细胞及固定剂：以经射线照射后的鼠3T3成纤维细胞作为饲养层细胞，可使胆管上皮细胞存活时间由1周增至4周，且细胞数也大大增加。胶原凝胶可作为固定剂，以长期保持体外培养细胞的极性。

（6）用鼠尾胶原或胶原蛋白包被的25mL培养瓶、24孔培养板或普通培养皿。

（7）手术刀、眼科剪、镊等。

步骤

（1）用戊巴比妥钠将家兔麻醉后剖腹从肝脏中分离胆囊。

（2）排净胆汁后将胆囊切开，用组织清洗液（DMEM中添加200U/mL青霉素及200ɥg/mL链霉素）清洗胆囊黏膜表面。

（3）在无菌条件下将胆囊黏膜面朝下，用0.125%Ⅳ型胶原酶溶液消化，置37℃下消化10～15min，加入适量含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液。

（4）将收集到的细胞悬液离心（1000r/min,5～7min），弃上清，调整细胞密度至（4~5）x10⁴/mL。

（5）将细胞接种在培养瓶或培养板内，37℃、5%CO₂培养4～7d细胞贴壁，每3d更换1次培养液。

操作提示

用Matrigel胶包被培养皿底壁，有利于上皮细胞贴壁生长。

结果及鉴定

培养早期细胞呈悬浮状生长，以后逐渐贴壁，10d左右形成单层细胞，细胞圆形且相互连接，培养10～14d后，细胞开始脱壁死亡。

常用胆管上皮细胞标志物的免疫荧光染色来证实胆管上皮细胞的起源。胆管上皮细胞的标志物有：细胞角蛋白7、19，γ-谷酰胺转肽酶（γ-GT）、人体上皮细胞抗原（HEA）、糖蛋白34（gp34）等。肝外胆管上皮细胞还对溶菌酶、胶原纤维连接蛋白、层粘连蛋白抗体呈阳性染色反应。