概念：

原代培养也叫初代培养，是从供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养，是建立各种细胞系的第一步，是从事组织培养工作人员必须熟悉和掌握的最基本的技术。原代培养的细胞具有很多特点。首先组织和细胞刚刚离体，其生物学特性未发生很大变化，仍具有二倍体遗传特性，最接近和反映体内生长特性，适合做药物敏感性测试、细胞分化等实验研究。而且，原代细胞未经体外培养传代对某些细胞的特性维持较好，可用于一些特殊实验的研究，如原代的软骨细胞则适合用于培养软骨细胞膜片。

虽然，原代培养是获取细胞的主要手段，但是，原代培养的组织由多种细胞成分组成，比较复杂，即使生长出同一类型细胞如成纤维样细胞或上皮样细胞，细胞间也存在很大差异。如果供体不同，即使组织类型、部位相同，个体差别也可以在细胞上反映出来。由于原代培养的细胞生物学特征尚不稳定，如要做较为严格的对比性实验研究，还需对细胞进行短期传代后进行。此外，如果是分离培养干细胞用于细胞膜片的培养构建，则不建议用原代细胞，原因是原代培养的细胞类型尚不单一，如果传代1~2次后再用于细胞膜片的构建，则成膜片效果会更好。

原代培养方法很多，最基本和最常用的是组织块法和消化法。

1.1组织块培养法

概述

组织块培养法是一种常用的简便易行且成功率较高的原代培养方法。即将组织剪切成小块后，接种于培养瓶。培养瓶可根据不同细胞生长的需要作适当处理。例如预先涂以胶原薄层，以利于上皮样细胞等的贴壁和生长，涂以多聚赖氨酸培养神经膜细胞等。如果原代细胞准备做组织染色、电镜等检查，可在做原代培养前先在培养瓶内放置无菌小盖玻片（小盖玻片要清洗干净，在消毒前放置）。组织块法操作简单，易于学习掌握。部分种类的组织细胞在小块贴壁培养24h后，细胞就从组织块边缘游出，继而，分裂繁殖。但由于在反复剪切和接种过程中对组织细胞的损伤，并不是每个组织块都能长出细胞。组织块法特别适合于组织量少的原代培养，如牙髓细胞培养等。

用品

（1）Hanks液(也可用无血清培养液)、培养液。

（2）无菌培养瓶(必要时瓶内可放置小盖玻片)、吸管和胶帽，小烧杯（20mL）或青霉素小瓶。

（3）眼科剪、眼科镊、直径5cm的培养皿或小玻璃板(8cmx5cm)，牙科探针。

步骤

（1）按照前述的培养细胞取材基本原则和方法取材、修剪，将组织剪切成约1mm大小的小块。在剪切过程中，可以适当向组织上滴加1~2滴含血清培养液以保持组织块湿润和尽可能减小组织细胞的损伤。

（2）将剪切好的组织小块，用眼科镊或吸管送人培养瓶内。用无菌牙科探针或弯头吸管将组织块在瓶壁上均匀摆置，每小块间距约5mm。组织块的量不要过多如25ml培养瓶，放置20~30组织小块为宜。如果瓶内有盖玻片，其上也放置几块。组织块放置好后，轻轻将培养瓶翻转，让瓶底朝上，向瓶内注人适量培养液，盖好瓶盖，将培养瓶倾斜放置在37 ℃孵箱内。

（3）放置2~4h待组织小块贴附后将培养瓶慢慢翻转平放，静置培养。此过程动作要轻巧，让液体缓缓覆盖组织小块。动作过快液体产生冲力可使黏附在培养瓶底的组织块漂起而造成原代培养失败。若组织块不易贴壁可预先在瓶底壁涂薄层血清或鼠尾胶原等以增加组织块黏附力。（图4-2）组织块法原代培养示意图

组织块培养也可不用翻转法，即在摆放组织块后，向培养瓶内仅加入少量含血清培养液，以能保持组织块湿润即可。盖好瓶盖，放入孵育箱培养4~24h再补加适量的培养液。

操作提示

剪切组织时一定要滴加1~2滴含血清培养液，可减少组织快漂浮。组织块接种后1~3d，由于游出细胞数很少，组织块的粘贴不牢固，在观察和移动过程中注意要动作轻巧，尽量不要引起液体的振荡而产生对组织块的冲击力使其漂起。在原代培养的1~2d内要特别注意观察是否有细菌、霉菌等的污染。一旦发现，要及时清除，以防给培养箱内的其他细胞带来污染。

对原代培养要及时观察，发现细胞游出后要照相记录。原代培养3~5d，需换液1次，瓶中漂浮的组织块和残留的血细胞或细胞生长较多时，全部更换新鲜培养液，细胞较少时，可换一半培养液。已漂浮的组织块和细胞碎片，含有有害物质，会影响原代细胞的活力和生长，应及时清除。

1.2消化培养法

概述

这种方法采用前述的组织消化分散法，将细胞间质包括基质、纤维等去除使细胞分散，可以很快得到大量活细胞，从而很方便的接种培养瓶进行快速培养，细胞可在短时间内生长成片。本方法适用于培养大量组织，原代细胞产量高;但步骤烦琐、容易污染，一些消化酶价格昂贵，实验成本高。

用品

消化法的用品和与前述的组织分离消化法基本相同。

步骤

（1）按消化分离法收获细胞。

（2）在消化过程中，可随时吸取少量消化液在镜下观察，如发现组织已分散成细胞团或单个细胞，则终止消化。通过孔径200目的网过滤掉残留的较大组织块。大组织块可加新的消化液后继续消化。

（3）已过滤的消化液800~1000r/min低速离心5min后，去除上清，加含血清培养液终止酶消化作用，轻轻吹打形成细胞悬液。如果用胶原酶或EDTA消化液等，尚需用Hanks液或无血清培养液洗1~2次后再加培养液重悬，细胞计数后、接种培养瓶，置CO₂培养箱培养。某些特殊类型细胞如内皮细胞、骨细胞等需用特殊的消化手段和步骤进行，将在正常细胞培养章节中叙述。对悬浮生长的细胞如白血病细胞、骨髓细胞和胸水、腹水等含有的癌细胞可不经消化直接离心分离收集，或经淋巴细胞分离液等梯度离心分离后，直接接种进行原代培养。

操作提示

采用消化分散法进行原代培养，一定要根据组织类型选择适宜的消化酶，尤其是注意选择适当类型的胶原酶。应当控制消化时间，避免消化过渡，造成细胞膜损伤，从而影响细胞贴壁及生长。首次进行原代培养时，适当提高接种细胞密度，有助于提高培养成活率。