器官培养基本技术简介

100多年以前Leob首次在含有少量血浆凝块的试管中培养成年免的肝、肾、甲状腺和卵巢，并发现它们在3d内仍保持正常的组织学结构。随着细胞培养技术的发展和器官培养研究的深人，科学家们发现体外器官培养中氧的供给是十分重要的。充分的氧气供给可以防止移植块的中心坏死。但氧的供给仅仅靠提高氧气浓度还不能解决问题，组织块完全浸人培养液中也无法保证有效供氧。目前人们已认识到，除皮肤外，大多数器官碎片或器官在固体支持物上比在液体培养基中能够更好地维持生长。下面介绍一些基本的器官培养方法。

（1）凝固的血浆基质培养法：FellHB和RobisonR（1929）创立“表玻璃法”，将器官碎片或器官放置在覆盖有凝固的鸡血浆和鸡胚胎浸出液的表面皿上培养，这一方法已成为研究胚胎原基形态发生的经典的标准技术。此法后来略作修改，用于研究成年哺乳动物组织中激素维生素及致癌因子的作用。

另一类型的培养容器是由含有血浆凝块并用玻璃片覆盖和石蜡封口的表面皿组成。Gaillar使用由2份人血浆，1份人胚胎血清，1份婴儿脑浸出物与6份平衡盐溶液组成的凝固物作培养基。血浆凝固物尽管能支持胚胎和成体器官的生长和发育，仍有许多缺点。它通常在移植块的周围液化，使移植块陷人培养基中。另外由于培养基的成分复杂，不能做生化分析。

（2）琼脂基质培养法：将血浆基质或鸡胚浸出液与消毒好的琼脂混合，形成较为稳定的半固体培养基，然后将器官组织片放置其上进行培养。此法已成功地用于发育和形态发生研究。

（3）漂浮法（“救生筏”法）：Chen JM（1954）发现擦镜纸是疏水性的，可以漂浮在液体培养基上。他在漂浮于血清液面的25mmx25mm镜纸上，接种4~5块培养物。Richter KM（1958）对此加以改进，对擦镜纸进行硅化处理，以防止它沉入培养基中。Lash等将擦镜纸与微孔滤膜结合使用。他们在漂浮的擦镜纸中央打小孔，然后用微孔滤膜条覆盖。不同类型的组织培养于微孔滤膜的任一表面上，并研究其相互作用和影响。Shafer用醋酸纤维膜（rayonacetate）代替擦镜纸通过将rayonacetate条的4个角做硅化处理，而使之漂浮在液体培养基上。Rayon acetate优于擦镜纸之处在于它溶于丙酮。因此，在组织学技术中，可以将它浸于丙酮中溶解去除。

（4）格栅培养法：液体培养基上漂浮的“救生筏”容易下沉，因此，组织块可能逐渐浸入培养基中。而Trowel OA（1959）设计的“格栅（grid）”培养技术可以克服这一缺陷。他引人金属格栅，最初是由铅丝网做成的。后来使用更硬和具延展性的金属，例如不锈钢或钛。格栅呈正方形，大小为25mmx25mm，将格栅的四边呈直角地做成约4mm高的平台。组织可直接培养于格栅上，但较软的组织（例如腺体或皮肤）则先接种于擦镜纸或微孔滤膜条带上，再放到格栅上。将格栅及其上面的外植体放置于培养皿内，添加培养液，充满到格栅的水平。格栅培养术最初是为了维持对氧需求比胚胎器官高的成体哺乳动物组织而设计的。因此，培养小室应放置在充满CO₂和O₂，混合气体的密闭容器内。本法可成功地保存成体组织的活力和组织学结构，例如前列腺、肾、甲状腺和垂体。这一技术，特别是气相的使用，在经过简化和改进后，至今仍广泛地沿用着。

（5）交替暴露于培养液和气相的培养法：近年来，一种使组织块交替的暴露于培养液和气相的方法也开始成功地用于人成体组织的长期培养，这些组织包括支气管上皮、乳房上皮、食道和子宫颈黏膜上皮。在此培养法中，器官组织块贴附于塑料培养皿的底部并用培养基覆盖，培养皿密闭于充有适当混合气体的气控小室内，然后将小室放置于一个摇转平台上，以每分钟数转的转速缓慢摇动培养皿，使培养液和气相交替通过组织块表面。

器官培养的基本操作

概述

上述各种器官培养方法尽管形式各样，但都需满足一些基本要求，下面以常用的格栅培养法（网状支架培养法）为例介绍器官培养的步骤和操作要求。

用品

除一般细胞培养用品外还需以下器材。

（1）不锈钢筛网（用做支架）。

（2）0.5 μm 微孔滤膜。

（3）器官培养的培养皿。

（4）如有条件建立三气道培养箱可以实现对培养环境中CO₂、O₂,浓度分别进行精确控制，可以极大地方便器官组织的体外培养。

步骤

（1）将不锈钢筛网做成支架形状(如凸型)，其高度为4mm或调整至培养皿的1/2深度平面，在其表面放置0.5μm孔径滤膜。

（2）将培养液加人培养皿，使液面刚刚接触到滤膜，但又不会使其浮起。

（3）将要培养器官组织放在滤膜上，一般厚度不要超过200~1000μm，水平面积不超过 10 mm²，如组织为肝、肾等，体积不能大于1mm³

（4）将上述准备好的培养物放入CO₂培养箱，并加注氧气调整氧分压，必要时可以调到 90%。

（5）培养过程中要注意观察培养液平面，尽可能保持在与滤膜一致的水平上。

（6）上述方法可进行器官培养1~3周，每3~5d换液1次，并根据情况做进一步实验和检测。

（7）培养完成的器官组织小块，可以取下直接进行石蜡包埋或冷冻切片或连同微孔滤膜一起进行组织学研究，也可以继续培养，或进行体内移植试验。

操作提示

器官培养对于成体组织器官培养一定要保持较高氧分压，可达到90%；对于胚胎组织器官或肿瘤组织可以适当降低氧分压，达到45%，尽量避免组织器官中心部位发生缺氧坏死。培养皿中加培养液一定要浸没组织器官高度的1/2，以保证营养物质交换。不同的器官培养，尚需一些特殊的条件，如某些生长因子、激素等，可参考相应文献。