（一）石蜡切片

组织经包埋制成蜡块后，再用切片机制成切片的过程称为石蜡切片（paraffin section）。切片是制片过程中很重要的环节，优质切片的要求是组织切片薄，平展，边缘齐，无刀痕、皱褶，龟裂，折叠等。将包有组织的石蜡块固定于切片机上即可开始切片，切片厚度一般以3~5µm为宜，脑组织和脂肪组织应稍厚，以 6~8µm 为宜。在普通染色和免疫组化染色过程中，组织切片需长时间浸泡在试剂内并经多次洗涤，有时需经高温抗原修复或蛋白酶消化，加之组织浸泡固定后会失去黏附性。这些因素都极易造成脱片，因此裱片所用的载玻片要预先进行防脱片处理。例如，在载玻片上涂抹APES胶、多聚赖氨酸、蛋白甘油等进行防脱片的预处理。

1.滑动式切片机的结构 以日本樱花滑动式切片机为例，切片机底座有两条轨道，一条是水平的，另一条有倾斜角。在水平轨道上，装载着切片刀的滑动台前后水平移动，倾斜轨道上有决定切片厚度的推进装置和固定蜡块的标本固定台。

2.切片机刀片角度及主要型号 刀片角度包括刀角、后角和前角。刀刃双侧面延长线交叉产生的角叫刀刃角，不同刀片型号反映其刀刃角度。蜡块和刀切削面形成的角为后角，可调。刀刃角与后角之和为前角，是切片操作实际需要的刀片角度。不同组织切片所需刀片型号不同（表2-3-7）。

3.切片操作方法切片前需准备好切片机、刀片、刀架、毛笔、展片器等。切片操作步骤（图2-3-24～图2-3-28）:

（1）将包埋好的蜡块固定于载物台上。

（2）上好刀架，移动滑动台使刀刃接触蜡块表面，再轻轻移动滑动台，先对蜡块进行粗修至蜡块中的组织完全暴露出。

（3）平移切片刀，换刀刃面进行薄切，一般情况下在薄切前用 3~5µm 刻度至少修切数十次。

（4）将微米杆调到欲切片的厚度上，切片常规厚度3~5µm。

（5）推拉滑动台，使刀刃在蜡块上轻轻移动。

（6）一边慢慢拉刀，一边将切下蜡片的一角贴在取片板上。

（7）一边移刀，一边取切片。

（8）将切片漂浮到展片的水槽中。

4.捞片与展片 将所切下的蜡片正面朝上，漂浮于43℃水槽表面，再把切片捞到载玻片上（载玻片与水面应呈直角），再移至43℃切片伸展台上展片。靠伸展台的温度使切片展开、干燥，使切片与载玻片贴紧石蜡的熔点为58~60℃时，展开切片的最佳温度在 40~45℃，温度过高易使切片发生龟裂。

5.捞片及注意事项

（1）捞取平整无皱褶的切片，去掉有刀痕、皱褶、龟裂、有气泡的切片。

（2）捞片时，镊子钩着蜡片边缘，避免划伤蜡片中心的组织。

（3）连续切片的顺序、方向、位置等应保持一致。

6.烤片 切片置于60℃烤箱烤2～4h或37℃过夜，保存于切片盒中备染。

7.切片注意事项

（1）刀刃锋利无瑕疵、无积屑是切片最基本的要求。

（2）切片时应注意被包埋的组织块是否已全部展示在切片上，特别是多个组织的复合包埋块，每个组织是否切全，有无刀痕、皱褶、龟裂、折叠、切片不全、破碎、组织松散、太厚或组织片呈现波浪状薄厚不匀等现象。

（3）切片机刀刃面与蜡块接触时要轻切削，避免切削过深蜡块出现刀痕（图 2-3-29）。

（4）骨、软骨、纤维肿瘤组织较硬，切片时切片刀易发生振颤出现颤痕，此时需更换切硬组织刀片，重者需返工，重新进行脱钙处理。

（5）防止切片龟裂，可用水蒸气加湿、加水等方法处理蜡块表面。

（6）切片速度均匀，滑动台运行速度不均匀影响切片厚度。

（7）粗修用的刀片，可用细切用过的旧刀片替换。

（8）脑垂体、肾上腺小组织切片时注意切面的完整性，如垂体的分叶、皮肤的表皮真皮是否切全

8.切片后蜡块的保存方法 切片后的蜡块如不加处理，会因组织块内残存的溶媒挥发而凹陷，所以切片后应迅速用熔化的蜡被盖。被盖蜡的温度要比蜡块融点高5℃，用与融点相近温度的蜡被盖，蜡易从蜡块表面脱落（图2-3-30）。

9.不满意的切片 出现刀痕、颤痕、裂痕、皱褶、龟裂、折叠、气泡、组织不完整、破碎、松散，组织片太厚或呈现波浪状薄厚不匀等。这些都属于制片过程中发生的问题。例如，脱水透明过度，切片龟裂，展片不平整、展片皱叠，切片机滑动速度不均匀出现搓痕等。这些问题将在各章节对具体脏器制片不理想原因中探讨。

（二）冷冻切片

冷冻切片（frozen section）因不需要经过逐级乙醇脱水、二甲苯透明等有机溶剂的处理步骤，能较好保存组织内酶、糖、脂和多种抗原（尤其是表面抗原）的抗原性，是组织化学和免疫细胞化学研究中常用的切片方法。在冰冻切片中，组织中水分易形成冰晶，影响酶和抗原的定位。含水量较多的组织脏器（如脑、心肌、骨骼肌）更易发生冰晶。冰晶形成的主要原因是冷冻速度缓慢、温度偏高、细胞内冷冻不均匀所致。可通过用异戊烷骤冷方法或冷冻保护剂（甘油和DMSO）等措施防止冰晶形成。

1.操作步骤 取出新鲜动物脏器组织修切好后，0.5h以内埋入已有 OCT（冷冻切片专用胶）的冷冻包埋盒内，或将组织放在软木塞、硬纸垫上用少量 OCT粘贴好，放入已经液氮预冷的异戊烷中，轻轻搅拌冷冻1min后，放入恒冷切片机内平衡温度 20min，在-20~-19℃条件下进行冷冻切片，切片厚度5~8µm。各脏器组织冷冻方法基本相同，只是要注意包埋面。脂肪组织冷冻切片温度要求更低一些通常在-25℃左右，切片厚度8~10µm（图2-3-31～图2-3-36）。

2.注意事项

（1）组织取材快速，骤冷速度快而均匀，搅拌冷冻可使受冷均匀。

（2）所取组织不能带有水分，否则容易形成冰晶，影响观察。

（3）骤冷时间不要过长否则组织碎裂，一般骤冷时间为1min。

（4）组织平整地埋入OCT中不能有气泡。

（5）一般防卷板调好后就不要再调，用组织去找防卷板切。

（6）在冷冻头上粘贴组织时注意，过多的OCT可冻融组织，又易形成冰晶。

（7）保护防卷板刃面，不要用硬的器械碰伤防卷板刃面，停机时在防卷板刃面与刀架之间放一块软布。