概述

细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻会导致冷冻损伤效应的发生。冷冻后，细胞内外的水分都会很快形成冰晶，冰晶的形成将引起一系列的不良反应。首先细胞脱水使局部电解质浓度增高，pH值改变，部分蛋白质由于上述因素而变性，引起细胞内部空间结构紊乱。细胞内冰晶的形成和细胞膜系统上蛋白质、酶的变性，引起溶酶体膜的损伤使溶解酶释放，造成细胞内结构成分的破坏、线粒体肿胀、功能丧失并造成细胞能量代谢的障碍。胞膜上的类脂蛋白复合体在冷冻中易发生破坏引起胞膜通透性的改变，使细胞内容物丧失。细胞核内DNA也是冷冻时细胞易受损伤部分。如细胞内冰晶形成较多，随冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成DNA的空间构型发生不可逆的损伤性变化，从而引起细胞的死亡。

冻存细胞的基本原则是，控制降温速率，要缓慢冷冻。在细胞冻存时要尽可能的均匀地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成是减少细胞损伤的关键。目前，多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂。这两种物质分子量小、溶解度大，易穿透细胞，在深低温冷冻后对细胞无明显毒性，可以使冰点下降，提高胞膜对水的通透性；加上缓慢冷冻方法可使细胞内的水分渗出细胞外，在胞外形成冰晶，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成所造成的细胞损伤。

用品

（1）0.25%胰蛋白酶。

（2）含10%～20%血清的培养液。

（3）二甲基亚砜（DMSO分析纯）。

（4）吸管、离心管、2mL专用细胞冻存管。

（5）细胞冻存专用的液氮生物容器。

步骤

(1) 从增殖期到形成致密的单层培养细胞都可以用于冻存，但最好选择对数生长期细胞，已经长满的细胞冻存复苏后生存率低。在冻存前一天最好换1次培养液，可以获得更多的分裂期细胞。

(2) 用0.25%胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则不需处理。依据传代方法把消化好的细胞收集于离心管并计数，1000r/min离心5min，去除胰蛋白酶及旧的培养液。

(3) 用配制好的冻存培养液（含10%DMS0的完全培养液）重新悬浮细胞，冻存液中细胞的最终密度为（5~10）x10⁶/mL。用吸管轻轻吹打使细胞均匀，然后分装入无菌冻存管中，每只冻存管加液1.5mL。

（4）冻存管必须旋紧确保密封。冻存管上应写明细胞的名称、冻存时间等信息。装入冻存盒同时做好记录。

（5）封好的冻存管即可进行冻存。通常有两种方法。一种是程序化细胞冻存仪，将冻存管放入仪器中直接按照降温程序冷冻至-100℃，然后，取出放入液氮生物容器中长期保存。标准的冻存程序为降温率-1~-2℃/min；当温度达到-25℃以下时，可增至-5~-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。要适当掌握降温速度，过快会影响细胞内水分透出，太慢则促进冰晶形成。各种细胞对冷冻的耐受性不同，一般来说上皮细胞和成纤维细胞耐受性大；骨髓细胞差一些，以不超过-2~-3℃/min 合适；而胚胎细胞耐受性最小。总之，在开始时温度下降速度不能超过-10℃/min。

另一种方法是分段降温冻存法。目前实验室常用的还有一种简易的细胞冻存盒（如美国Nalgeneᵀᴹ公司出品的细胞冻存盒），内部充满异丙醇，将冻存管放置其中。把冻存盒放入-85℃冰箱中，可以实现-1℃/min的降温速率冻存细胞。如无此设备一般可以采用以下几种冻存方法来控制冷冻速率。

①先将冻存管直立放置于冻存盒中周围固定，以免倾倒。将安置好的小盒放入小型泡沫包装盒内，然后再放入-85℃冰箱中，尽可能减缓降温速率，经过3h以后，取出冻存管移入液氮容器内。在放入液氮罐时，要戴手套操作以免冻伤。

②可以将标记好并装入冻存管支架，从液氮容器口缓缓放入，按1℃/min的降温速度，在30～40min时间内使其到达液氮表面。再停30min后，直接投入液氮中。

液氮数量要定期检查，如发现液氮挥发一半时要及时补充。补加液氮时要做好眼、手、脚等身体暴露部位的防护，以免冻伤。为妥善起见，特别是很多未被冻存过的细胞在首次冻存后要在短期内复苏1次，观察细胞对冻存的适应性。已建系的细胞最好也每年复苏1次后，再继续冻存。