初始CD4+ T细胞在体外可以通过特定的刺激和细胞因子诱导分化为不同类型的T细胞，包括Th（辅助性T细胞）和Treg（调节性T细胞）等。

初始CD4+ T细胞的分化基础：初始CD4+ T细胞是适应性免疫应答的重要组成部分，其分化方向受到多种因素的调控，包括抗原的性质、局部环境中的细胞因子及激素等。

分化为Th细胞：

Th1细胞：在IL-12等细胞因子的诱导下，初始CD4+ T细胞可以向Th1方向分化。Th1细胞主要分泌IFN-γ等细胞因子，参与细胞免疫应答，对抗细胞内病原体和某些肿瘤。

Th2细胞：在IL-4等细胞因子的诱导下，初始CD4+ T细胞可以分化为Th2细胞。Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10等细胞因子，促进体液免疫应答，有助于清除细胞外病原体和寄生虫。

Th17细胞：在TGF-β和IL-6等细胞因子的共同作用下，初始CD4+ T细胞可以分化为Th17细胞。Th17细胞主要分泌IL-17等细胞因子，参与抵抗细胞外细菌和真菌的感染，并在自身免疫性疾病中发挥重要作用。

分化为Treg细胞：在TGF-β单独或与其他细胞因子（如IL-2）的共同作用下，初始CD4+ T细胞可以分化为Treg细胞。Treg细胞具有免疫抑制作用，能够抑制其他免疫细胞的活化和增殖，维持免疫稳态。它们通过分泌抗炎因子（如IL-10和TGF-β）和细胞间接触依赖机制来发挥抑制作用。

综上所述，初始CD4+ T细胞在体外通过不同的细胞因子刺激可以分化为具有不同功能的T细胞亚群，这些亚群在免疫应答中发挥着各自独特的作用。

实验步骤

一.初始CD4+ T细胞分离

使用EasysepTM mouse naïve CD4+ T cells isolation kit阴选出脾脏中的初始CD4+ T细胞 (naïve CD4+ T cells)。如果在96孔板中刺激诱导，每孔铺1 x 10^5 naïve CD4+ T cells，以下均以1 x 10^5细胞为例。

二.CD3和CD28预先铺板

Th0，Th1和Treg这3种细胞使用purified NA/LE hamster anti mouse CD3e和purified NA/LE hamster anti mouse CD28预先铺板，两个的铺板工作浓度均为1 μg/ml (PBS稀释)，96孔板铺板体积为50 μl。可在4 °C预铺12~16小时或者37 °C预铺2小时。

Th17细胞铺板浓度不同，purified NA/LE hamster anti mouse CD3e工作浓度 2 μg/ml，CD28工作浓度 5 μg/ml。

预铺结束，缓慢吸走上清，开始洗板子，即缓慢加入1640完全培养液室温静止5分钟，吸走。洗三次，注意最后一次在加入细胞前再吸走培养液。

三.刺激分化

Th0细胞培养: 每孔200 μl 1640完全培养液悬起细胞，其中加入细胞因子工作浓度为：anti-IL-4:10 μg/ml, anti-IFN-γ:10 μg/ml；

Th1细胞培养: 每孔200 μl 1640完全培养液悬起细胞，其中加入细胞因子工作浓度为：IL-12:10 ng/ml, IL-2:10 ng/ml, anti-IL-4:10 μg/ml（图1）；

图1. Th1细胞流式结果示意图

Th2细胞培养：每孔200μl1640完全培养液悬起细胞，其中加入细胞因子工作浓度为：IL-4:10ng/ml,IL-2:5ng/ml,anti-IFN-y:10 μg/ml, anti-IL-12:10 μg/ml,加 CD3/CD28 beads:2.5 μl beads(2.5 μl beads/105 cells)(图 2);

注：Beads提前用1640完全培养液洗三遍，后加入培养液中。

图2.Th2细胞流式结果示意图

      Th17细胞培养：每孔200ulIMDM完全培养液悬起细胞，其中加入细胞因子工作浓度为：IL-6:30 ng/ml,TGF-β:3 ng/ml TNF-α: 10 ng/ml, IL-1β: 10 ng/ml, anti-IFN-y: 5 μg/ml, anti-IL-4:5 μg/ml(图3)。

图3.Th17细胞流式结果示意图

Treg细胞培养：每孔200ul1640完全培养液悬起细胞，其中加入细胞因子工作浓度为：IⅡL-2:5ng/ml,TGFβ:3ng/ml（图4)。

图4.Treg细胞流式结果示意图

72小时后轻轻吸走100叫培养液，再次加入细胞因子种类及浓度和之前一样的100ul培养液，再培养24小时后，PI reboost3~4小时后检测各细胞诱导比例。

注意事项

1、用加入细胞因子的培养液悬起细胞后，尽量轻柔的将细胞加到板里，避免吹起之前铺好的anti-CD3/CD28抗体。

2、当刺激细胞数量比较大时，48小时开始每12小时观测细胞浓度，如果细胞密度很大，则立即铺加刺激，将培养液分到新的孔中，同样在最初刺激96小时后检测。96孔板最多培养初始3x10⁵细胞，更多细胞则需要按比例依次换更大的孔板。

溶液配方

1、1640完全培养基

    1640培养基加10%FBS

    加双抗(100x)

    加50 μMMercaptoethanol

2、IMDM完全培养液

    IMDM培养基加10%FBS

    加双抗(100x)

    加谷氨酰胺(100x)

    加5μMMercaptoethanol

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