1 原代培养的首次传代

1.1 概述

原代培养后由于细胞游出数量增加和细胞的增殖，单层培养细胞相互汇合，整个瓶底逐渐被细胞覆盖。这时需要进行分离培养，否则细胞会因生存空间不足或密度过大导致的密度接触抑制，以及营养物质缺乏等影响细胞生长。细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶的过程称之为传代;进行一次分离再培养称之为传一代。原代培养的首次传代是很重要的，是建立细胞系关键的时期。

1.2 注意事项

（1）细胞没有生长到足以覆盖瓶底壁的大部分表面以前(80%)，不要急于传代。

（2）原代培养时细胞多为混杂生长上皮样细胞和成纤维样细胞并存的情况很多见，传代时不同的细胞有不同的消化时间，因而要根据需要注意观察及时进行处理。并可根据不同细胞对胰蛋白酶的不同耐受时间而分离和纯化所需要的细胞。另外，早期传代的培养细胞较已经建系的培养消化时间相对较长。吹打细胞时动作要轻巧尽可能减少对细胞的损伤。

（3）首次传代时细胞接种数量要多一些，使细胞能尽快适应新环境而利于细胞生存和增殖。随消化分离而脱落的组织块也可一并传入新的培养瓶。

2 细胞传代培养的方法

2.1 概述

培养细胞传代根据不同细胞采取不同的方法。贴壁生长的细胞用消化法传代；部分贴壁生长但贴附不牢固的细胞也可用直接吹打传代；悬浮生长的细胞可以采用直接吹打或离心沉淀后再分离传代，或直接用自然沉降法吸除上清后，再吹打传代。

2.2 材料与仪器

【材料】细胞

【试剂】0.25%胰蛋白酶工作液：RPMI1640培养基（含10%小牛血清）

【仪器，耗材】倒置显微镜、CO₂细胞培养箱、吸管、培养瓶/皿、超净工作台、封口膜、酒精

2.3 步骤

一、贴壁细胞：以HeLa细胞的传代培养为例

（1）选取生长密度80%左右即处于生长对数期的HeLa细胞，在超净工作台中操作，吸去培养皿中的旧培养基，加入1-2mL的PBS溶液，轻轻润洗，漂洗细胞以除去残留的血清。

（2）吸去培养皿中的PBS溶液，加入1-2m 0.25%胰蛋白酶消化液（消化液能够覆盖细胞即可)，吸弃培养基，将培养皿置37℃、5%C0₂培养箱消化2~3min(如消化程度不够，可延长时间)，倒置显微镜下观察细胞，当大部分细胞变圆且亮时，加入等体积含10%FBS的培养基终止消化。

（3）用移液枪轻柔吹打细胞使其成为细胞悬液。将细胞悬液转移到1.5ml离心管中，室温，1000rpm,离心5min。

（4）离心后，用吸引器轻轻吸去上清，加入1ml完全培养基重悬细胞，按照1皿细胞传2皿或3皿比例进行传代（不同细胞特性不同，分盘比例适当调整)，将1皿细胞的细胞悬液一分为二或者一分为三后分别转移到新的培养皿中。

（5）接种好的细胞，应在培养皿上标记上细胞名称、细胞代数、本次传代日期和操作人姓名，轻轻摇匀后转移到37°℃、5%C0₂培养箱中培养。

（6）细胞培养24h后，根据培养基的颜色及细胞的生长密度进行相应的操作（更换新鲜培养基或者填次传代处理或者进行冻存处理)

二、悬浮细胞或半贴壁细胞的传代培养

因悬浮细胞不贴壁（半贴壁细胞贴壁不紧），故传代时不必采用酶消化方法，而可直接传代或离心收集细胞后传代，具体过程如下：

（1）直接传代：

即让悬浮细胞慢慢沉淀在瓶底后，将上清吸取1/2-2/3，然后用吸管吹打形成细胞悬液后，再进行传代。

（2）离心方法传代：

1）取状态良好的细胞，在生物安全柜中操作，用移液管把细胞轻柔吹打均匀。

2）把细胞悬液转移到15mL离心管中，1000rpm离心5min。

3）轻轻吸去上清后用完全培养基重悬细胞，按照1皿细胞传2皿或3皿比例进行传代，把细胞悬液一分为二或者一分为三后分别转移到新的培养皿中。如有必要可计数，然后传代接种。

4）接种好的细胞，应在培养皿上标记上细胞名称、细胞代数、传代日期和操作人姓名，轻轻摇匀后转移到37C、5%C0₂培养箱中培养。

5）细胞培养24h后，根据培养基的颜色及细胞的生长密度进行后续相应的操作（更换新鲜培养基或者再次传代处理或者进行冻存处理）。

部分贴壁生长细胞：不经消化处理直接吹打也可使细胞从壁上脱落下来，而进行传代。但这种方法仅限于部分贴壁不牢的细胞。直接吹打对细胞损伤较大，导致较大数量的细胞丢失，因此绝大部分贴壁生长的细胞均需消化后，才能吹打传代。

2.4注意事项

（1）把握传代时机，已如前述，在80%~90%汇合阶段最好，过早传代细胞产量少，过晚细胞健康状态不佳。

（2）消化时间要适度，消化时间过短细胞不易从瓶壁脱落，过长细胞可脱落流失。

（3）消化液浓度要适宜，过浓时消化作用强烈，细胞反应快，所需消化时间短，掌握不好，细胞易流失。对于贴壁细胞传代培养，通常采用0.25%胰蛋白酶很容易使细胞脱离瓶壁，但是，对于上皮组织来源的细胞需要采用消化作用更强的消化液，常用0.01EDTA-0.125%胰蛋白酶混合消化液。

（4）各种细胞对消化反应不同，有的敏感，有的迟钝，因此应根据所用细胞特点制定适宜消化措施。有的细胞附着瓶壁不牢，如Hela细胞等，可用吸管可从瓶壁直接吹下来，但这样容易伤害细胞，细胞大片脱落掉，不易计数，应尽可能采用消化法分散细胞为妥。使用含EDTA的消化液，务必进行离心洗涤细胞，除净EDTA，否则，影响细胞贴壁和生长。

（5）吹打时动作要轻柔不要用力过猛，同时尽可能不要出现泡沫，这些都对细胞有损伤。

（6）细胞传代比例依细胞生长速度而定，通常正常细胞传代比例为1:2~1:3，肿瘤细胞1:5-1:10。细胞传代间隔时间要相对稳定，不要忽长忽短，以免影响培养细胞的生物学性状。