培养细胞相差显微镜观察

在细胞培养工作中，无论从形态上或从功能上对细胞进行研究，对活细胞的观察都是最基本内容。倒置相差显微镜是观察培养中的活细胞的必备工具。

概述

在一般情况下，人眼只能在光波的波长（颜色）和振幅（亮度）发生变化时，才能看到被检物体。但大部分生物体，特别是细胞在生活状态下，都呈无色透明光线通过这些物体时波长和振幅并不发生变化，因此，应用普通显微镜无法看清活细胞的形态和结构。相差显微镜原理则与之不同。它主要利用光在通过不同物质时的折射和物体厚度差别，产生衍射而引起的光程变化，光程的变化引起相位差即相差的变化来观察物体结构。一般情况下人眼不能分辨相差，而相差显微镜利用光的衍射和干涉现象，把相差变为明暗之差，就可以分辨出被检物体的结构。

步骤

（1）调正光轴：要想利用显微镜清晰地观察细胞结构，必须首先将显微镜调整好。调整显微镜重要内容之一是调整光轴。首先用低倍镜，并把照明灯虹彩关至最小，使光落于视野中央；如有偏斜可用聚光器的调整螺丝进行调整。然后打开虹彩使视野内呈均匀照明强度并使目的物图像达到最大限度反差为止。

（2）相位板合轴调节：相差显微镜的相差装置由两部分组成，即相差聚光器和相差物镜。每个相差物镜中都有一带环状光栅的透镜，在聚光器里有数个可转换的相位板；一定倍数的物镜要配相应的相位板。目前，常用的相差显微镜的相位板上都刻有倍数，相位板与相对倍数的相差物镜配合使用。首先保证光轴居中，将环状光栅与相位板调整重合，环状光栅不能过大或过小，也不能偏移一侧，才能达到最好的相差效果。

（3）调焦与摄影：现代较高级的倒置显微镜，视野中间都有双线十字，调焦前先转动目镜使十字的双线清晰，即目镜与观察者的视力相配，然后再调节物镜（用调焦旋钮）使观察物质清晰。在照相目镜上也要采用同样步骤调焦。有时摄影目镜和观察目镜焦点不相一致，这时根据需要调焦，照相时以摄影目镜为主，观察时以观察目镜为主。

照相时应做好记录，把细胞种类、代数、观察内容、放大倍数、时间等记录，以备查寻和对比。

操作提示

（1）用于活细胞观察的培养器皿要求较高，培养瓶的上下壁必须是尽可能平行的平面。如培养瓶底平面不平行，则不可能得到良好的相差像；瓶壁不能太厚，否则也引起影像失真。经标准化生产的培养板、培养瓶/皿一般成像效果都较好。但反复刷洗过的玻璃或塑料培养器/皿将严重影响显微镜的分辨力，因而如果器皿的划痕过多将不能再用于活细胞的观察和照相记录。天气较冷时从温箱中取出培养瓶在室温中观察活细胞，由于温度差别培养瓶内壁有雾滴形成影响显微镜观察的清晰度，此时可轻轻将瓶倾斜使瓶内培养液浸润内壁，就可以重新得到好的相差像，

（2）若作原代培养细胞的相差显微镜照相，可选择换液后进行，这样可以将漂浮的组织块和死细胞去除，提高成像清晰度。

（3）在培养室中观察细胞也要有无菌观念，在搬动培养瓶时动作要轻巧，不要猛烈振荡，不要接触瓶口区域以防污染每次观察时间不能太长，以免温度过低影响细胞生长。每次观察时不要把细胞全部取出，要分次分批进行，尽可能减少细胞在外暴露时间。

培养细胞的动态观察

培养细胞的附着、贴壁、伸展、移动、有丝分裂等活动是连续动态的，是培养细胞观察中最为生动的部分。要做到细胞动态观察一般不仅需有较好的相差倒置显微镜，最好还有显微镜恒温装置和连续、定格缩时拍摄电影或录像装置。例如，活细胞工作站。

拍摄培养细胞的动态电影需首先对要观察的细胞活动周期进行预观察，掌握其大致的活动时间。如一个细胞从多边形到圆球形然后进入分裂，最后又贴壁伸展这是一个细胞分裂活动的全过程，一般时间数小时到十几小时不等，要把它变成很短时间内的动态影像需根据以后放映时所要的时间进行换算。正常放映速度为每秒放映24幅，这样就可以把较长的细胞分裂时间在放映时压缩为数秒或十几秒内完成。用此方法可以观察很多生动的细胞运动变化影像。具体时间的估算一般按下述公式计算：

缩时的间隔时间=“目的物”活动时间(s)/[24x要求影片放映时间(s)]

如果没有拍电影装置，利用自制恒温装置或在室温较高时也可采用简易的固定视野连续照相的方法进行培养细胞的动态观察。