概述

细胞计数法是细胞培养研究中的一项基本技术，它是了解培养细胞生长状态测定培养基、血清、药物等物质生物学作用的重要手段。常用的细胞计数有血球计数板计数法和电子细胞计数仪计数法。

用品

（1）血球计数板、巴氏吸管、盖玻片。

（2）0.25%胰蛋白酶溶液、无血清培养液。

（3）显微镜。

步骤

（1）准备计数板：用无水乙醇或95%乙醇清洁计数板及专用盖玻片，然后用绸布轻轻拭干。

（2）制备细胞悬液：用消化液分散单层培养细胞或直接收集悬浮培养细胞，制成单个细胞悬液。本法要求细胞密度1x10⁴~1x10⁵/mL，若细胞数很少，应将悬液离心（1000r/min，5 min），重悬浮于少量培养液中。若细胞密度过大，需要适当稀释后进行计数。

（3）加样：用吸管轻轻吹打细胞悬液，取少许细胞悬液，在计数板上盖玻片的一侧加微量细胞悬液。

（4）计数：在显微镜下，用10X物镜观察计数板四角大方格中的细胞数。细胞压中线时，只计左侧和上方者，不计右侧和下方者。

（5）计算：将计算结果代入下式，得出细胞密度。

细胞数/毫升原液=(4大格细胞数之和/4)x10⁴x稀释倍数

另外，随着电子计数仪的出现，使大规模细胞计数工作自动化成为现实。目前，已有多种型号的自动计数仪，其基本工作原理是，用PBS液（磷酸盐缓冲液）或生理盐水适当稀释细胞悬液，移入样品杯中，将样品杯放置在计数仪微孔管下计数仪吸取0.5ml样品进行计数。被吸取的细胞穿过微孔时改变了流经微孔的电流，产生一系列脉冲信号，计数仪借以进行分类、计数。不同型号的计数仪其操作程序不尽相同，使用时应详细参照仪器说明书进行。

操作提示

（1）消化单层细胞时，务求细胞分散良好，制成单细胞悬液，单个细胞率应大于95%。否则会影响细胞计数结果。

（2）加样时不要溢出盖玻片也不能溢入两侧的玻璃槽内，如果产生上述情况需对计数板冲洗和拭干后重新加样，加样量也不要过少或带气泡。

（3）取样计数前，应充分混匀细胞悬液。在连续取样计数时，尤应注意这一点。否则，前后计数结果会有很大误差。

（4）镜下计数时，遇见2个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算。如细胞团占10%以上，说明消化不充分；或细胞数少于2/mm²或多于50/mm²时，说明释释不当，需重新制备细胞悬液、计数。

（5）对于压边线的细胞，采用单边计数原则，只计压上边线和左边线的细胞，不计压下边线和右边线的细胞。

[细胞密度换算]

在细胞培养实验设计中，常根据设计需求制备一定量、一定密度的细胞悬液，这就涉及细胞密度换算问题。

细胞密度换算实际上仍根据溶液稀释公式，即溶液稀释前后溶质含量保持不变。

C1·V1=C2·V2：式中C1、V1代表溶液稀释前的浓度和体积；C2、V2代表溶液稀释后的浓度和体积。例如：欲配制10mL，1x10⁶/mL细胞密度的细胞悬液，现有1x10⁷/mL的细胞悬液若干毫升，应如何稀释？

已知：C1=1x10⁷/mL，C2=1x10⁶/mL，V2 =10 mL。

求V1。根据上式得：

V1=(C2·V2)/C1

=1x10⁶x10/(1x10⁷)

=1 mL

即取细胞密度为1x10⁷/mL的细胞悬液1mL，补加9mL培养液，即成10mL,1x10⁶/mL的细胞悬液。