一、实验原理 定量逆转录聚合酶链反应（Quantitative Reverse Transcription PCR，简称qRT-PCR）是一种分子生物学技术，用于定量检测RNA的量。它结合了逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和荧光定量检测技术。以下是qRT-PCR的基本原理： 1. 逆转录反应： qRT-PCR的第一步是将RNA模板逆转录成cDNA。这个过程使用逆转录酶，它能够根据RNA模板合成互补的DNA链。通常，这个过程包括一个随机或特异性引物的添加，它提供了逆转录酶开始DNA合成的起点。 2. PCR扩增： 在cDNA合成后，进行聚合酶链反应（PCR）来扩增特定的DNA片段。PCR包括变性（高温使DNA双链分离）、退火（引物与单链DNA模板结合）和延伸（DNA聚合酶添加核苷酸，延伸DNA链）的循环过程。这个过程会大量复制目标DNA片段。 荧光定量检测： qRT-PCR的定量部分是通过在PCR反应混合物中加入荧光染料或荧光标记的探针来实现。荧光染料（如SYBR Green）在结合到双链DNA时会发出荧光信号，而探针（如TaqMan探针）则是通过探针上的荧光报告基团和淬灭基团之间的相互作用来检测荧光信号。在PCR扩增过程中，随着目标DNA片段的增加，荧光信号也会相应增强。 数据收集与分析： 荧光信号的增强与PCR循环数（Ct值，阈值循环数）相关，Ct值是指在PCR反应中，荧光信号首次达到一个预设阈值时的循环数。Ct值越低，表示初始模板的浓度越高。通过比较样本和标准品的Ct值，可以定量初始RNA的量。 qRT-PCR的优势在于其高灵敏度、高特异性和快速的结果获取能力，它可以用于基因表达分析、病原体检测、基因型鉴定以及许多其他分子生物学研究。 二、实验流程 1. 引物设计：引物设计需遵循一般原则，产物长度应控制在80-150 bp，以保证扩增效率和特异； 2. RNA提取：提取细胞总RNA，包括清洗、裂解、分离和沉淀RNA步骤； 3. RNA反转录：使用反转录酶将RNA转换为CDNA，作为qPCR的模板； 4. qPCR反应体系配置：实验通常使用2×浓缩的real-time qPCR MasterMix。需要加入模板和引物。每个样品至少做3个平行孔，以确保数据的可统计性； 5. 上机操作：将配置好的反应液放入实时qPCR仪中，设置相应的温度循环和采集模式，进行扩增检测； 6. 数据分析：根据实验结果进行数据分析，包括标准曲线法或相对表达量法计算目标基因的表达量。 qRT-PCR流程图 三、送样要求 1. RNA样品 提供的RNA总量不低于10 µg，浓度不低于200ng/ul，尽量大于500 ng/µl。A260／280应在1.8-2.0之间。样本放入-80℃冰箱中贮存，干冰运输。 2. 组织样品 组织离体15分钟内，切成黄豆大小（直径约0.5 cm）的小块，用PBS或生理盐水洗净。随后将样本小块置于液氮中速冻，放入EP管中保存，再放入-80℃冰箱中或者液氮罐中保存，干冰运输。 3. 细胞样品 去除干净培养基，将离心后的细胞放入液氮或-80℃冰箱中保存。细胞总量不低于107个，干冰运输。