一、实验原理 蛋白免疫印迹（Western Blot）是一种用于检测和分析特定蛋白质表达情况的分子生物学技术。以下是该技术的实验原理详细介绍： 蛋白免疫印迹利用特异性抗体来识别和着色经过凝胶电泳处理的细胞或生物组织样品中的蛋白质。通过分析蛋白质的着色位置和深度，可以获得特定蛋白质在样本中的表达信息。 二、实验步骤： 1. 样品制备： 细胞或组织样品经过裂解和蛋白质提取，得到蛋白质混合物。 2. 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）： 将蛋白质混合物通过PAGE进行分离，根据蛋白质的大小将其分开。 3. 转膜：通过电转移或压力转移的方法，将凝胶中的蛋白质转移到固相载体（如硝酸纤维素膜或聚偏氟乙烯膜）上。这一过程称为转膜。 4. 封闭：转膜后的固相载体需要用 blocking agent（如脱脂奶粉或BSA）进行封闭，以减少非特异性结合。 5. 一抗孵育：将固相载体上的蛋白质与特异性第一抗体孵育，第一抗体能够识别并结合特定的蛋白质抗原。 6. 清洗：孵育后，清洗掉未结合的一抗，以减少背景信号。 7. 二抗孵育：接着，将固相载体与标记的第二抗体孵育，第二抗体与第一抗体结合，并通过酶标记或同位素标记来增强信号。 8. 清洗：再次清洗掉未结合的二抗。 9. 显色或放射自显影：根据第二抗体上的标记类型，进行底物显色反应或放射自显影，以可视化蛋白质条带。 三、送样要求 离体后迅速超低温处理并-80 ℃冻存，干冰运输； 组织样本：动物组织应不少于100 mg；细胞样本：大于5×106个细胞； 细胞或组织裂解液总蛋白浓度须大于1 mg/mL，单个样品不少于50 μL。 四、应用 蛋白免疫印迹技术广泛应用于检测蛋白质水平的表达，包括但不限于蛋白质的定性、定量分析，蛋白质相互作用的研究，以及信号转导路径的探索。通过这种方法，研究人员可以准确地识别和量化目标蛋白质，为进一步的生物学研究提供重要信息。